酵母双杂交，酵母双杂交法的原理

大家好，关于酵母双杂交很多朋友都还不太明白，今天小编就来为大家分享关于酵母双杂交法的原理的知识，希望对各位有所帮助！

酵母双杂交的特点

酵母双杂交*的最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。酵母双杂交*检测蛋白之间的相互作用具有以下优点：⑴作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。⑵检测在活细胞内进行，可以在一定程度上代表细胞内的真实情况。⑶检测的结果可以是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用。⑷酵母双杂交*可采用不同组织、*、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。例如已报道成功分析了RAP1与RIF1ii、P21cip1与CDK2iii、p16与CDK4iv等之间的相互作用。

酵母双杂交法的原理

酵母双杂交法的原理：

典型的真核生物转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域：DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

扩展资料：

酵母双杂交*能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。主要是由于：

1、采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

2、信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

3、杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

4、通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型，X-Gal及H*3蛋白表达等检测方法均很敏感。

在研究蛋白质的结构功能特点、作用方式过程中，有时还要通过突变、加*等手段*蛋白质间的相互作用。针对实际工作中的这种需要,Vidal等人发展了所谓的逆双杂交*（reversetwo-hybridsystem）。

这项技术的关键是报道基因URA3的引入。URA3基因在这里起到了反选择的作用，它编码的酶是尿嘧啶合成的关键酶。

参考资料来源：百度百科——酵母双杂交

酵母双杂交实验有哪些注意事项

注意事项

（1）酵母双杂交对照的设定常规的酵母双杂交*作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色*对照三种对照，以MATCHMAKERGAL4酵母双杂交筛选*为例：

阳性对照：pGADT7-T+pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。

阴性对照：pGADT7-T+pGBKT7-lam，其中已经明确T蛋白和lam蛋白在酵母细胞内不能发生结合。*显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色*是否有问题。

（2）假阳性现象多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：

筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。

酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。

这种情况需要对阳性*再次划板2~3次，以确保每一个酵母*中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将pGADT7-cDNA质粒与pGBKT7-bait质粒的载体对调构建成pGADT7-bait与pGBKT7-cDNA并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。

（3）常见的问题及参考方案转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在2~3mm左右的酵母*，以确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度。

杂交效率偏低—可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用共转化的方法进行试验；或者将单转的酵母*分别铺到5块10mm的培养板上，待*长出来以后，刮取所有*于5mL0.5×YPDA中。重悬后再按照常规杂交*作步骤进行*作。背景过高—当使用H*3作为报告基因时，由于H*3基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的H*3蛋白竞争性*3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如Ade。

诱饵蛋白具有自激活现象——可以采用*突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会*两蛋白之间的相互作用。

酵母菌双杂交到底是什么 请解释一下

100字有点困难，但是还是可以试试，如果有疑问可以追问。

酵母双杂交是一种用于检测两种蛋白是否互作的一种手段。实验中将A蛋白与转录激活因子连接，B蛋白与另一个转录因子（比如RNA聚合酶的alpha亚基）融合。如果A能够和B发生互作，那么转录激活因子就可以激活报告基因的转录，从而使菌株产生某些特性（抗性或能够在基本培养基上生长），反之则不能。

参考资料：http://baike.baidu*/link?*l=gzze1w*vxbMwPcV8xUjouZsKo1gCjEVnSCm7QeV0m-3CW_1od9IqgWbY25byn91OzKfM5kGeMRah5KdaccKta

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